ORIENTAÇÕES

Como regra geral, deve-se transportar e estocar:

a) amostras de soro sanguíneo em geral devem ser mantidas sob refrigeração e analisadas dentro de no prazo máximo de 72 horas e quando mantidas congeladas a ? 20ºC por período indeterminado;
b) amostras de água em geral devem ser mantidas sob refrigeração e analisadas dentro de no máximo 30 horas após a colheita, não devendo ser congeladas. Amostras de água engarrafadas podem ser transportadas e estocadas à temperatura ambiente, se mantidas na sua embalagem original, fechada e intacta. Uma vez aberta a embalagem, essas amostras devem ser resfriadas e analisadas em, no máximo 24 horas. O tempo entre a colheita e o recebimento da amostra no laboratório não deve exceder a 24 horas para águas tratadas, 12 horas para águas não tratadas e 6 horas para águas muito poluídas. No caso de amostras transportadas em temperatura ambiente, o prazo não deve exceder a 2 horas;
c) amostras de leite em geral devem ser mantidas sob refrigeração e analisadas dentro de no máximo 24 horas após a colheita, não devendo ser congeladas;
d) amostras de urina em geral devem ser mantidas sob refrigeração e analisadas dentro de no máximo 24 horas após a colheita, não devendo ser congeladas;
e) amostras de fezes, órgãos, suabes, fluídos, fetos mumificados destinados a análises microbiológicas, devem ser mantidas sob refrigeração e analisadas dentro de no máximo 72 horas após a colheita, não devendo ser congeladas. Dependendo do agente virológico a ser pesquisado, a amostra deve ser mantida e transportada em meio de transporte específico e/ou congelada;
f) amostras de insumos de ração, ração, destinados a análises bacteriológicas, podem ser mantidas em temperatura ambiente, podendo ser mantidas sob refrigeração até o momento da análise;
g) amostra de sêmen /in natura/ ou diluído como para inseminação artificial devem ser transportadas sob refrigeração quando para ensaio bacteriológico; quando para morfologia espermática, se o sêmen for in natura ou diluído transportar à temperatura aproximada de 18ºC e quando diluído em formol citrato transportar em temperatura ambiente.

Nota

• O ideal é que estas amostras cheguem ao laboratório o mais rápido possível;
• Quando as amostras apresentarem inconformidades identificadas na análise crítica, as mesmas serão mantidas no laboratório em temperatura adequada para o seu armazenamento e será feito contato imediato com o cliente.

A colheita deverá ser feita de modo a evitar a contaminação com produtos e outros microrganismos presentes no ambiente ou no próprio animal. Por essa razão, frascos, tubos, seringas, agulhas e demais instrumentais a serem utilizados devem estar estéreis. Quando não for possível a utilização de frascos estéreis, recomenda-se lavar com água e detergente e ferver em água limpa, no mínimo, durante 30 minutos. Amostras contaminadas por produtos ou microrganismos que não estão envolvidos na etiologia da doença dificultam a realização da prova e a interpretação dos resultados.

As etapas da coleta exigem o cumprimento de algumas normas que podem ser assim resumidas:

a) A amostra de sangue coletada deve cobrir no mínimo 50% da capacidade de um tubo ou frasco de 10 mL.
b) Para se obter um soro adequado para análise, os tubos com sangue devem ser mantidos à temperatura ambiente por, no mínimo, 2 ou 3 horas, ao abrigo da luz, até que ocorra a coagulação sangüínea. Após a separação do coágulo, transferir o soro para um frasco estéril. Não usar frascos ou tubos úmidos, porque pode hemolisar o sangue;
c) O soro deve ser conservado refrigerado e enviado o quanto antes ao laboratório evitando-se assim, a deterioração da amostra. Em caso de demora no envio (mais de 72 horas), deve-se congelar o soro e enviar sob refrigeração. Nos casos de sorologia para micoplasmoses e salmoneloses não congelar os soros e enviar o mais breve possível para o laboratório;
d) Os tubos devem ser identificados de tal forma que o número corresponda ao especificado no formulário de solicitação de exames.

O sucesso no cultivo bacteriológico de amostras de campo depende de uma série de fatores que podem interferir no diagnóstico laboratorial como a forma de colheita, tipo de peça anatômica, quantidade de amostra, acondicionamento, transporte, tempo após a colheita e tempo de estocagem.

Os procedimentos para coleta de amostras para exame bacteriológico são descritos a seguir.

4.1 Colheita de amostras de água

Retirar no Laboratório CEDISA frascos de colheita estéreis.

- Desinfetar a área externa da torneira ou tubulação com etanol.
- Flambar a torneira ou tubulação se o material for resistente ao fogo.
- Deixar a água fluir durante 2 a 3 minutos.
- Desinfetar as mãos com etanol.
- Abrir o frasco de coleta cuidando para que a parte interna da tampa não entre em contato com a mão ou qualquer outro objeto.
- Deixar encher o frasco de colheita até ¾ de sua capacidade.
- Fechar o frasco de colheita.
- Colocar o frasco de colheita em saco plástico.
- Acondicionar o frasco em um isopor com gelo.
Particularidades
a) Para colher água de poços que não possuem uma tubulação ou torneira de descarga deve-se utilizar preferência, um balde de metal. Lavá-lo interna e externamente, desinfetá-lo com etanol e flambá-lo. Submergir o balde na água após a flambagem e, quando cheio, verter a água para o frasco estéril até ¾ de sua capacidade.
b) Para colher água de reservatórios utilizar o próprio frasco de coleta usando uma pinça de braços longos. Havendo essa impossibilidade, proceder como na colheita de poços
c) Para colher água de rios, arroios, lagos, vertentes, etc., deve-se proceder como na colheita em reservatórios tomando-se o cuidado de dirigir a boca do frasco de coleta em sentido contrário à correnteza.

4.2 Colheita de amostras de leite

- Deve-se colher o leite nos casos de suspeita de mastites.
- Antes da coleta o úbere deverá ser lavado e adequadamente seco. A seguir realiza-se a anti-sepsia da extremidade do teto, com solução anti-séptica (álcool 96°GL ou álcool 70%). Realizar primeiro a anti-sepsia dos tetos mais distais em relação ao operador e, após, o restante dos quartos mamários, para evitar que ocorra re-contaminação durante a limpeza.
- Para a coleta, utilizar tubos estéreis de 20 mL, preferencialmente com tampa de rosca, sendo que no momento da colheita desprezar os primeiros 3 ou 4 jatos de leite. É recomendável que durante a colheita o tubo permaneça aberto o menor tempo possível.
- Aproximadamente 5 mL de leite são suficientes. As amostras de cada quarto mamário deverão ser coletadas em frascos individuais, pois a causa da infecção pode não ser a mesma.
- Antes de colher de outro animal, proceder à anti-sepsia das mãos e a troca de luvas.
- Os frascos devem conter a identificação do quarto mamário coletado.
- Após a colheita, conservar as amostras sob refrigeração e enviar ao laboratório, o mais breve possível, preferencialmente em até 24 horas.

4.3 Colheita de amostras de suabes

A colheita de material para análise laboratorial através de suabes pode ser feita nos casos de diarréia, secreções nasais, descargas vulvares, meningite estreptocócica, pneumonias e outros.
- Utilizar suabes estéreis flexíveis de aproximadamente 15 cm, podendo conter meio de transporte se o período entre a colheita e o recebimento no laboratório exceder 24 horas.
- O frasco deve ser aberto somente no ato da colheita.
- Em casos de descarga vulvar o material é colhido com movimento de pincel na região da vulva e vagina profundamente.
- Nas diarréias pode-se colher diretamente da região do reto ou indiretamente no material fecal.
- Para cavidade nasal realiza-se introdução profunda do suabe e com um movimento de pincel colhe-se o material para exame.
- Para colheita no cérebro, após abrir a caixa craniana, passar o suabe na intersecção dos dois hemisférios do cérebro e do cerebelo.
- Nos casos de pneumonias, passar o suabe dentro do abscesso (quando houver), na parede dos pulmões quando há presença de fibrina, no local onde há hepatização. Sendo aconselhável nesses casos enviar o pulmão ao laboratório.
- Após a colheita o suabe deve voltar imediatamente para dentro do frasco.
- Todos os frascos devem ser etiquetados para melhor identificação.
- As amostras devem ser colocadas em caixas de isopor com gelo embalado para manter a refrigeração.

4.4 Colheita de amostras de fezes

O exame de fezes é muito importante principalmente nos casos com suspeita de colibacilose neonatal e outras diarréias, intoxicações, ileítes e outros.
a) Para colheita utilizam-se frascos ou sacos plásticos estéreis;
b) Nestes casos colhe-se material diretamente do reto do animal. Em caso de suspeita de salmonelose colher aproximadamente 25 g de fezes;
c) Todas as amostras devem ser identificadas com o número do animal;
d) As amostras devem ser colocadas em caixas de isopor com gelo embalado para manter a refrigeração.

4.5 Colheita de amostras de urina

O exame de urina é importante na identificação de infecções urinárias.
a) Para colheita utilizam-se frascos estéreis.
b) Colhe-se uma amostra de no mínimo 10 ml da primeira urina espontânea da manhã, antes do arraçoamento, desprezando-se os primeiros jatos, colhendo-se a urina a partir da segunda metade da micção. Somente abrir a tampa do frasco no momento da colheita e fechá-lo imediatamente após.
c) Todas as amostras devem ser identificadas com o número do animal.
d) O material deve ser acondicionado em caixa de isopor contendo gelo e o seu envio ao laboratório, o mais breve possível.

4.6 Colheita de órgãos

- Para a identificação de certos agentes, pode-se proceder à colheita de órgãos (pulmão, intestino, traquéia, baço, fígado, ovário, etc.).
- No caso de órgãos, deve-se utilizar material estéril (tesouras, pinças, bisturi).
- Colher o mais assepticamente possível e colocar os órgãos em recipientes estéreis (placas de Petri, frascos plásticos, frascos de vidro, sacos plásticos).
- No caso do intestino, devem-se amarrar as pontas da porção a ser colhida.
- Acondicionar cada órgão em um recipiente separado.
- No caso de aves, podem-se colocar alguns órgãos juntos dentro do mesmo frasco ou saco, desde que não se misturem órgãos do aparelho digestivo.
- Todas as amostras devem ser identificadas com o número do animal.
- O material deve ser acondicionado em caixa de isopor contendo gelo para o seu envio ao laboratório.

O sucesso no cultivo virológico de amostras de campo depende de uma série de fatores que podem interferir no diagnóstico laboratorial como a forma de colheita, tipo de peça anatômica, quantidade de amostra, acondicionamento, transporte, tempo após a colheita e tempo de estocagem. A fase aguda da doença é o período com maior possibilidade de detecção do vírus. Ou seja, sempre que possível colher material para o isolamento do vírus ou para a detecção antigênica no início da enfermidade, quando estão presentes os sinais clínicos.

Os procedimentos para colheita de amostras para exame virológico são descritos a seguir.

5.1 Procedimentos para a colheita de amostras destinadas a realização de ensaios virológicos:

Os materiais de predileção para serem enviados para a detecção de vírus são tecidos colhidos durante as necropsias e/ou de abortos, de secreções tais como: secreções nasais, vaginais, prepuciais, sêmen, leite, fezes, conteúdo intestinais ou uterinos, líquidos de vesículas, sangue integral e soro.
a) Colher os órgãos de animais com quadro clínico compatível ao da suspeita, após o sacrifício ou logo em seguida da morte, de forma mais asséptica possível, não devendo ser utilizados instrumentos com os quais se fez a necropsia;
b) Existindo a suspeita clínica, na realização da necropsia, colher inicialmente os órgãos alvo de escolha para a doença em questão, e posteriormente o restante. c) Os órgãos podem ser coletados inteiros. Se for necessário seccionar, o fragmento a ser submetido deve incluir o tecido com a lesão;
d) Para conservação de órgãos e tecidos, utiliza-se a refrigeração. Em caso de demora no envio (mais de 72 horas), pode-se, porém nem sempre é aconselhável, congelar o material e enviá-lo sob refrigeração;
e) Não é recomendável o congelamento de amostras para o isolamento viral, pois temperaturas de 0 ºC a -40 ºC podem inativar alguns vírus. Se for inevitável o congelamento das amostras, utilizar gelo seco ou nitrogênio líquido. A exceção ocorre quando for referente a algum vírus que tolere temperaturas de até -20 ºC. Também pode ser utilizados meios específicos que conservem a amostra;
f) Formol, glutaraldeído, álcoois ou outros produtos químicos não devem ser utilizados para a remessa de amostras para diagnóstico virológico, pois estas substâncias podem inativar os vírus;
g) Secreções para isolamento viral devem ser colhidas com suabe sem alginato de sódio, uma vez que esta substância inativa alguns vírus;
h) Os suabe devem ser colocados em frascos ou embalagens estéreis e mantidos refrigerados, enviados em embalagem tripla;
i) Se for inevitável o congelamento das amostras, utilizar gelo seco ou nitrogênio liquido, quando se desejar o isolamento viral, pois temperaturas de 0 ºC a -40 ºC podem inativar alguns vírus;
j) A amostra deve ser remetida ao laboratório o mais breve possível, já que as secreções são colhidas, geralmente, para isolamento viral ou detecção antigênica.

6.1 Colheita para pesquisa de sarnas

Raspados profundos da lesão, especialmente das bordas, são os mais apropriados para a pesquisa de ácaros causadores de sarna. A colheita deve ser feita da seguinte maneira:
a) Fazer uma prega na pele do animal, próxima às bordas da lesão. Dar preferência para regiões da base das orelhas e pavilhão auricular (inclusive cerúmen);
b) Pingar algumas gotas de óleo (mineral ou de soja) sobre a prega de pele;
c) Raspar, preferencialmente, com auxílio de uma cureta, sobretudo quando for no pavilhão auricular. Raspar a pele várias vezes com uma lâmina de vidro ou de bisturi usada, em ângulo de 90° em relação à pele, promovendo escarificação profunda até o aparecimento de pequenos pontos de sangue. Quando usar lâminas cortantes para fazer a escarificação, não enviar as mesmas junto com o material colhido. Há riscos de acidente;
d) Colocar o material em tubos cônicos, microtubos. Sempre dando preferência a frascos com tampa. Evitar frascos muito grandes, placas de petri. e) Um raspado colhido adequadamente deve conter, além da escarificação de pele, pequena quantidade de sangue e pelos.

6.2 Colheita para pesquisa de hemoparasitos

a) Com auxílio de uma agulha hipodérmica, colher uma gota de sangue periférico (orelha) ou sistêmico (cauda ou jugular) diretamente sobre uma lâmina; b) Imediatamente, fazer um esfregaço de sangue. Com auxílio de outra lâmina acoplada em um ângulo de 45 ºC sobre a gota de sangue, tracionar sobre a lâmina, de modo que o sangue se espalhe uniformemente formando uma fina película de sangue;
c) Identificar cada lâmina com um número de ordem, o qual deverá corresponder à identificação do animal em uma ficha de colheita e identificação do animal;
d) Caso haja mais colheitas, separar cada lâmina com auxílio de papel absorvente. Manter em temperatura ambiente e enviar ao laboratório;
e) Pode-se colher sangue com EDTA e enviá-lo ao laboratório para que este faça o esfregaço.

As amostras para exame histopatológico não podem ser congeladas e devem ser colhidas na necropsia logo após a morte do animal, para evitar autólise. Deverão ser remetidas em solução fixadora de formol a 10%. Os fragmentos precisam ser pequenos (máximo de dois centímetros de comprimento e 1 cm de espessura) e devem estar imersos em formol a 10% na proporção de uma parte de tecido para dez ou mais partes de formol (1:10).

Procedimento:
a) Escolha um local limpo para proceder a colheita;
b) Avalie o órgão a ser colhido, observando as alterações morfológicas;
c) Colher um fragmento de aproximadamente 2 cm;
d) Imergir imediatamente o fragmento em solução de formol a 10%;
e) Os frascos necessitam ter boca larga e serem fechados hermeticamente. Um frasco de colheita nunca deve ser completamente preenchido, sendo recomendável utilizar-se no máximo ¾ de sua capacidade;
f) Identificar o frasco com identificação do animal;
g) Identificar, no formulário de solicitação de exames, todas as amostras colhidas.

Fatores que interferem na fixação e/ou conservação das amostras para exame histopatológico:
- Baixas temperaturas: em regiões de clima frio (região Sul) ou em temperaturas baixas pode ocorrer precipitação do formol, que diminui a capacidade de fixação dos tecidos. O mesmo ocorre quando o formol é refrigerado, que retarda a fixação e prejudica a visualização dos tecidos sob o microscópio. Portanto, recomenda-se não acondicionar as amostras para exame histopatológico na mesma caixa de transporte com materiais resfriados ou congelados destinados para outras análises (bacteriológico, virológico, sorológico). Preferencialmente, durante as épocas mais frias do ano, enviar as amostras em formol para exame histopatológico em caixas isotérmicas ao invés de caixas de papelão, para evitar que a temperatura interna da caixa se iguale às baixas temperaturas do ambiente. Caso as amostras estejam em formol há mais de 48 horas, quando a fixação está praticamente completa, é possível enviar as amostras na mesma caixa de transporte que outras amostras refrigeradas, pois depois que as amostras estão fixadas não ocorre o processo inverso. No entanto, nunca congelar as amostras para exame histopatológico, mesmo após a fixação.

- Precipitação do formol: as baixas temperaturas podem produzir grumos ou névoa no fundo do recipiente em que o formol preparado para uso está armazenado, tornando a concentração desigual. Nesses casos recomenda-se aquecer o formol por algumas horas em temperatura em torno de 25°C. Isso pode ser feito deixando os recipientes com formol em ambiente climatizado ou mantê-los em caixas isotérmicas. Isso também pode ocorrer com o formol puro (37%) e as mesmas recomendações podem ser utilizadas antes da diluição.

- Tamanho dos fragmentos: para que a fixação seja adequada, os tecidos não devem ser maiores que 2,0 x 1,0 x 1,0 cm para órgãos sólidos, como fígado, baço, rim, músculo, etc. Para o intestino, as fezes devem ser retiradas delicadamente, sem raspar a mucosa com a tesoura ou pinça. Os fragmentos de intestino podem ser lavados delicadamente em um recipiente com água para a remoção das fezes. O intestino pode ser enviado aberto (com vários centímetros de comprimento) ou fechado (com cerca de 2-3 cm de comprimento) e com aberturas de 0,5 cm nas extremidades para facilitar a penetração do formol. Se o encéfalo for enviado apenas para exame histopatológico ele pode ser fixado inteiro (respeitando a proporção adequada de tecido/formol (1:10). Caso outra análise também for requisitada, recomenda-se cortar o encéfalo ao meio no sentido longitudinal e fixar uma metade em formol e manter a outra metade refrigerada ou congelada (conforme o exame solicitado).

- Manipulação dos tecidos: o manuseio excessivo dos tecidos durante a necropsia pode interferir na qualidade das amostras, causando esmagamento das células e produzindo artefatos que prejudicam a visualização sob o microscópio. Recomenda-se atenção especial com o encéfalo e intestino.

- Algodão hidrofóbico: o uso de algodão hidrofóbico, principalmente em casos de colheita de pulmão pode interferir na qualidade das amostras, pois quando a quantidade de algodão é excessiva ocorre compressão dos tecidos no fundo ou laterais do frasco com formol, diminuindo uma das superfícies de absorção. Se possível, evitar o uso do algodão. Tecidos que flutuam, como os pulmões, fixam bem sem o algodão. Quando o pulmão está com lesão (ex. inflamação), o fragmento afunda e não é preciso usar o algodão.

- Relação tecidos/formol: deve-se respeitar a relação entre a quantidade de amostras e formol durante a colheita para obter completa fixação. Recomenda-se colocar uma parte de amostras para 10 ou mais partes de formol a 10%. As amostras precisam ficar "confortáveis" dentro do frasco. Evitar colocar os tecidos no frasco vazio (antes de adicionar o formol), porque os fragmentos podem grudar uns nos outros ou no fundo do frasco, e impedir a fixação pelo formol.

ANÁLISE DE DETECÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E TIPIFICAÇÃO DE AGENTES POR PCR
A colheita para análise de PCR deve ser realizada com materiais estéreis, para evitar contaminação. O material deve ser refrigerado, e caso ultrapasse 48 horas para ser enviado ao laboratório, o mesmo deverá ser congelado.

Material de eleição, conforme agente a ser pesquisado: Detecção de Mycoplasma hyopneumoniae: Suabe de narina, suabe de tonsila, pulmão.

Detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae: suabe de tonsila, pulmão.

Detecção de Haemophilus parasuis: suabe de narina, suabe de tonsila, suabe de pleura, meninge, líquido pericárdico, líquido sinovial.

Detecção de Brachyspira pilosicoli e B. hyodysenteriae: fezes, suabe de reto, intestino.

Detecção de Lawsonia intracellularis: fezes, suabe de reto, intestino.

Detecção de Circovírus: pulmão, linfonodo, intestino, coração, feto.

Quantificação de Circovírus: soro, plasma.

Tipificação de Actinobacillus pleuropneumoniae: cultura bacteriana.

Detecção de Mycoplasma gallisepticum: suabe de traquéia, traquéia, pulmão.

Detecção de Mycoplasma synoviae: suabe de traquéia, traquéia, pulmão.